Какая сальмонелла наследила

Доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии БГМУ кандидат мед. наук Вероника Слизень проводит MLVA-анализ для молекулярно-генетического типирования сальмонелл. Фото автора

Немного истории

Если оглянуться на не очень далекое прошлое, можно увидеть, что самая распространенная сегодня острая бактериальная кишечная инфекция — сальмонеллез — стала известна чуть более 130 лет назад. Случилось это благодаря усилиям американских ветеринарных врачей Дэниела Сэлмона и Теобальда Смита, впервые выделивших возбудителя. С тех пор микроорганизмы новой группы, вызывающие заболевание человека и животных, пользуются повышенным вниманием медиков и специалистов животноводства и птицеводства.

Замечено, что с 1960-х годов среди возбудителей сальмонеллезов в Беларуси и некоторых других странах стремительно увеличивается доля Salmonella serovar Enteritidis. В 1970–1990-е этот серовариант обеспечивал уже до 90% заболеваемости. Такое триумфальное шествие возбудителя связано с его способностью скрытно хозяйничать на птицефермах и проникать в яйца. 

У второго по значимости микроорганизма — Salmonella serovar Typhimurium — иная «специализация». Он распространяется преимущественно с продукцией животного происхождения — говядиной, свининой. И если посмотреть на размах развития птицеводства в нашей стране, легко понять, почему доминировать стала Salmonella serovar Enteritidis. 

Что бактерии «на руку»

В Беларуси сальмонеллезы дают высокую заболеваемость среди бактериальных кишечных инфекций — 45 случаев на 100 000 жителей. Как считают медики, эта тенденция напрямую связана с интенсификацией сельскохозяйственного производства, укрупнением сети общепита, глобализацией рынка продуктов, расширением географии и развитием международной торговли. Кроме того, «на руку» бактерии и мода на потребление сырых и полуприготовленных мясных изделий. 

Но в вопросе, как противостоять микроорганизму, полной ясности по-прежнему нет. Сальмонелла борется за жизнь, вырабатывает устойчивость к антибактериальным препаратам, усиленно приспосабливается к меняющимся условиям среды.

Выяснить, как ей это удается, — такую цель поставили ученые БГМУ — специалисты кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии и лаборатории внутрибольничных инфекций, а также их коллеги из РЦГЭиОЗ. 

В рамках проекта государственной программы научных исследований «Медицина и фармация» 

(подпрограмма «Фундаментальная и прикладная медицина») исследовательская группа БГМУ в составе руководителя научно-исследовательской части Елены Гудковой, доцента кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Вероники Слизень, заведующего лабораторией внутрибольничных инфекций Геннадия Скорохода и ведущего научного сотрудника лаборатории ВБИ Жанны Циркуновой разработала метод молекулярно-генетического типирования сальмонелл. Они изучили циркулирующие в стране генетические варианты, составили карту их распространения по областям, оценили резистентность возбудителей к антибио­тикам. 

Найти отпечаток среды

Сальмонеллы имеют территориальные особенности, едва заметные различия внутри одного вида или сероварианта. Контактируя с другими микроорганизмами, они вовлечены в обмен генами и приобретают отличительные черты — свое­образный отпечаток среды обитания. Такая информация должна облегчить поиск ответа на вопрос: откуда они происходят? Появилась возможность получить генетические профили сальмонелл, встречающихся только на конкретных птицефабриках и производствах. 

— Изучение генетических вариантов возбудителей сальмонеллезов, циркулирующих в стране, и разработка методов определения происхождения бактерий позволяют поднять на новый уровень санитарно-эпидемиологический контроль и обеспечение безопасности пищевых продуктов, — считает ответственный исполнитель задания Вероника Слизень. — Еще недавно бывало: в кафе вспышка сальмонеллеза, образцы бактерий взяты у заболевших, из продуктов, с объектов внешней среды, а доказать сходство между выделяемыми сальмонеллами затруднительно. И это несмотря на то, что молекулярно-генетические подходы для типирования главных возбудителей сальмонеллезов, в принципе, известны, но в практику отечественного здравоохранения до сих пор не внедрялись. Фенотипически все сальмонеллы — и Salmonella serovar Enteritidis, и serovar Typhimurium — одинаковы. Наши же методы позволяют увидеть генетическое различие или сходство возбудителей и судить о возможном происхождении. 

Оба метода утверждены инструкциями Минздрава и успешно используются в Республиканском центре гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья, в практике санитарных служб, весьма заинтересованных в официально зарегистрированной высокоточной технологии для проведения эпидемиологических расследований. 

Кстати, как считают авторы, опыт использования отечественных подходов говорит, что вспышки сальмонеллеза в организациях общепита должны рассматриваться как маркер неблагополучия в первую очередь на предприятиях — поставщиках сырья, что требует оперативного расследования и реагирования, в т. ч. со стороны ветслужб.

ПЦР и тандемные повторы 

Первый метод основан на полимеразной цепной реакции, но если кто-либо считает, что ученые изобрели велосипед, у авторов есть на это резонное возражение. Да, метод ПЦР известен, но исполнители проекта адаптировали его к конкретной задаче, предложили оригинальные праймеры, новые флюоресцентные зонды к генам, свои генетические последовательности, на основании которых проводится идентификация серовариантов либо определяются генетические варианты. 

Иными словами, новаторство в дополнении известных мишеней для идентификации сальмонелл нетрадиционными, что расширило возможности лабораторной диагностики. В то же время ПЦР остался тем же проверенным методом молекулярной биологии, хорошо освоенным санитарными службами, успешно эксплуатирующими эту «рабочую лошадку». 

Второй метод — современный и более трудоемкий, — основан на использовании секвенатора — прибора, определяющего последовательность нуклеотидов в ДНК. Благодаря ему выявляют различия микроорганизмов по вариабельному количеству тандемных повторов. Последние — словно припевы в песнях — многократно повторяющиеся однотипные фрагменты в ДНК микроорганизмов, и по их количеству в разных участках ДНК можно описывать генетический профиль возбудителя, сравнивать микроорганизмы, циркулирующие в Беларуси, Европе, мире. 

В рамках проекта был разработан и метод одновременной идентификации с помощью ПЦР в реальном времени основных возбудителей сальмонеллезов Salmonella serovar Enteritidis и serovar Typhimurium. 

— Генетическая идентификация, — поясняет Вероника Слизень, — становится более дешевой, есть отечественные производители расходных материалов для ПЦР, многие исследовательские центры оснащены соответствующими приборами. Поэтому генетический метод идентификации сальмонелл для выявления ключевых серовариантов, обеспечивающих до 95% заболеваемости, вполне заменим серологическим, правда, требующим закупки диагностических сывороток за пределами страны. Серологическую же идентификацию можно было бы сохранить для других серовариантов сальмонелл, не относящихся к Enteritidis и Typhimurium. 

Таким образом, разработанные подходы к распознаванию основных возбудителей сальмонеллезов и их молекулярно-эпидемиологическому типированию позволили получать информацию о территориальном распространении генетических вариантов возбудителя и добывать сведения об источниках инфекции, факторах передачи. Возможно устанавливать или исключать связи между отдельными случаями заболеваний, дифференцировать эпидемические вспышки на фоне спорадической инфекции, отслеживать пути ее распространения, обеспечивать мониторинг эпидемиологического благополучия в лечебных учреждениях. 

Не все антибиотики эффективны

Что касается разработки новых методов лечения, такая цель перед учеными пока не ставилась. Хотя исследователи, изучившие сопротивляемость сальмонелл бета-лактамным антибиотикам, сделали интересные наблюдения и в научных публикациях дают рекомендации врачам. Например, исследование более 400 штаммов сальмонелл, выделенных в разных регионах республики, показало: циркулируют возбудители, устойчивые к ампициллину, что связано с продукцией ферментов бета-лактамаз класса TEM и АСС. При этом резистентные формы с АСС генами могут быть невосприимчивы и к ингибитор-защищенным пенициллинам, и к цефалоспоринам 1–2-го поколения. 

Позитивный момент, считают ученые, в том, что пока среди сальмонелл фактически отсутствуют варианты, продуцирующие бета­лактамазы расширенного спектра действия (цефотаксимазы, расщепляющие цефалоспорины 3­го поколения, и карбапенемазы, расщепляющие карбапенемы). Поэтому применение ампициллина, а также защищенных пенициллинов при сложившихся условиях может быть неэффективно в педиатрической практике. Во всяком случае, их нельзя рассматривать как препараты стартовой терапии сальмонеллезов.

А вот ципрофлоксацин, используемый для лечения взрослых, продолжает быть активным. Мониторинг показал, что резистентности к нему у сальмонеллы пока нет. Все тестируемые культуры бактерий сохраняют чувствительность и к цефалоспоринам 3-го и 4-го поколений — цефотаксиму, цефтриаксону, цефепиму, а также к фторхинолонам и левомицетину. 

На территории Беларуси с высокой частотой стали встречаться сальмонеллы, противодействующие тетрациклину, особенно среди Salmonella serovar Typhimurium, поскольку в животноводстве широко применяют препараты тетрациклинового ряда. Последние могут не дать желаемого результата в терапии.

В рамках проекта отслеживали и сероварианты сальмонелл, дающие рост заболеваемости в Европе и странах Азии — S. Mikawasima и S. Stanley. Не обошли они стороной и нас, но пока в республике выделяются единичные «завозные» случаи, связанные с этими вариантами. 

Ученые также проанализировали циркуляцию S. Typhimurium с пентарезистентностью ACSSuSpT, т. е. к ампициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, сульфаниламидам, спектиномицину и тетрациклинам. Несколько лет назад этот микроорганизм получил эпидемическое распространение во многих странах. Но за все время наблюдения в Беларуси зарегистрировано только 5 изолятов с таким профилем. 

Ключ к международным проектам

Новые методы типирования прекрасно вписываются в технологии, используемые в странах-лидерах. Полученные в республике результаты могут сразу же включаться в мировые банки генетических вариантов сальмонелл, и это позволит рассчитывать на эффективное международное сотрудничество. С начала 2000 года в ВОЗ действует международная программа по надзору за сальмонеллезами (WHO Global Salm–Serv 

— WHOGSS), и на ее базе функцио­нирует глобальная система контроля чувствительности этих бактерий к противомикробным препаратам (External Quality Assuarance System — EQAS).

В конце минувшего года проект завершился, но исследования продолжаются благодаря усилиям региональных и республиканского ЦГЭиОЗ, работам ученых кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и лаборатории внутрибольничных инфекций БГМУ. 

Продолжение следует...

В научной работе по генетическому изучению сальмонелл участвуют и кружковцы БГМУ, в первую очередь студенты медико-профилактического факультета. Начиная с 2-го курса они осваивают все премудрости генетических методов исследования и биоинформатики — компьютерного анализа генетической информации, приобретают навыки молекулярно-эпидемиологического типирования сальмонелл и уже к концу учебы прекрасно ориентируются в ДНК-технологиях. А еще, что крайне важно, так прививается любовь к будущей профессии. 

Исследования сальмонелл, которые ведут студенты медико-профилактического факультета Мария Якимова, Мария Костенко, Ксения Богданович, Анастасия Шульга, Ксения Червяковская, педиатрического факультета — Виктория Назарова, далеко не ученические — занимали призовые места на Республиканском конкурсе научных работ, а докладу Марии Якимовой по сальмонеллам присудили 1-е место в секции на международной конференции «Молодежь в науке», которую проводит НАНБ. 

СПРАВОЧНО

Согласно международному мониторингу 2012–2016 гг., источником сальмонеллы могут оказаться: 

• огурцы (S. Saintpaul), 
• говяжий фарш (S.Typhimurium), 
• арахисовое масло (S. Bredeney, S. Typhimurium, S. Tennessee), 
• мякоть манго (S. Braenderup), 
• мускусная дыня (S. Typhimurium, S. Newport, S. Panama), 
• свежие плоды папайи (S. Agona), 
• проростки семян (S. Enteritidis, S. Newport, S. Saintpaul, S. Enterica), 
• пшеничные отруби (S. Agona),
• сухой корм для собак (S. Infantis), 
• сырой полуфабрикат тунца (S. Bareilly, S. Nchanga), 
• турецкие кедровые орехи (S. Enteritidis), 
• мясо домашней птицы (S. Hadar, S. Montevideo, S. Newport, S. Lille, S. Infantis), 
• утиное мясо (S. Altona, S. Johannesburg), 
• гамбургеры из индейки (S. Hadar), 
• фарш индейки (S. Heidelberg), 
• яйца и куриное мясо (S. Enteritidis).
  
  Дмитрий Патыко
  Фото автора
  Медицинский вестник, 14 апреля 2016